Comment naissent les impuretés peptidiques : ce qui peut mal tourner entre la synthèse et le stockage

Les impuretés peptidiques sont tous les composants d'un échantillon de peptide autres que le peptide visé. Certaines sont le peptide lui-même sous une forme altérée : un résidu manquant ou modifié, ou un changement de structure. D'autres sont des résidus de processus qui subsistent après la fabrication. Dans les peptides de recherche, la plupart des impuretés peuvent être attribuées à la synthèse, au clivage et à la déprotection, ou à la dégradation qui se poursuit pendant le traitement et le stockage. Les séquences supprimées et tronquées, les formes oxydées et désamidées, ainsi que les solvants ou réactifs résiduels font partie de celles rencontrées le plus souvent.Leurs origines diffèrent, tout comme l'importance de chacune. Certaines se forment avant même que le peptide ne soit complètement assemblé. D'autres apparaissent après la purification, dans un lot qui répondait à sa spécification de pureté lors de son test. Savoir où un changement est susceptible de se produire rend les résultats analytiques plus faciles à lire et donne aux chercheurs un point de départ lorsque les expériences ne concordent pas.

Quelles sont les impuretés peptidiques ?

Pour le dire simplement, une impureté est tout composant de l'échantillon qui n'est pas le peptide visé. Il peut s'agir d'une copie modifiée du peptide, ou de quelque chose laissé après sa fabrication. Les analystes classent généralement les impuretés en deux groupes.Les impuretés liées aux peptides forment le premier groupe. Considérez-les comme des quasi-copies de la cible : un résidu perdu ou gagné, une chaîne latérale portant le mauvais groupe chimique, un stéréocentre inversé. Les séquences de délétion appartiennent ici, tout comme les peptides oxydés et désamidés.Le deuxième groupe couvre tout ce qui n'est pas un peptide : solvants résiduels, réactifs de synthèse restants et autres résidus de processus. L'eau et les contre-ions sont un cas légèrement différent. Un peptide purifié avec du TFA finit généralement sous forme de sel de trifluoroacétate, ou sous forme d'acétate après échange de contre-ions, et un peu d'eau reste presque toujours. Les deux ont tendance à être signalés séparément plutôt que regroupés avec les impuretés.La distinction compte pour comprendre la pureté des peptides. Un pourcentage de pureté HPLC décrit la part relative des composants détectés, selon une méthode particulière. Il ne vous dit pas combien de peptide se trouve dans le flacon par poids. Ce deuxième chiffre est la teneur nette en peptide, et l'écart entre les deux est plus notable dans les matériaux de recherche fournis sous forme de poudre lyophilisée.

Étape 1 – Comment les impuretés se forment pendant la synthèse peptidique

La plupart des peptides de recherche synthétiques proviennent de la synthèse peptidique en phase solide, ou SPPS. La chaîne en croissance repose sur des billes de résine, et les acides aminés sont ajoutés un par un. Chaque cycle doit être presque complet ; si ce n'est pas le cas, l'erreur reste dans cette chaîne pour le reste de la synthèse. Peut-être qu'un résidu ne parvient pas à se coupler, ou se couple là où il ne devrait pas. Peut-être qu'une étape s'arrête à mi-chemin, ou qu'une réaction secondaire modifie la chaîne. Chacun de ces événements finit par devenir une impureté. Les séquences plus longues donnent à ces événements plus de chances de se produire. D’Hondt et ses collègues passent en revue les principales classes d'impuretés liées aux peptides associées à la synthèse et au traitement ultérieur.

Séquences manquantes, supplémentaires et incomplètes

Trois impuretés liées à la séquence apparaissent le plus souvent :Séquences de délétion : un ou plusieurs acides aminés manquent, généralement parce qu'une étape de couplage n'a pas été complète.Séquences d'insertion : un acide aminé supplémentaire s'est glissé dans la chaîne.Séquences tronquées : la chaîne a cessé de croître avant d'atteindre sa pleine longueur.Parce que ces variantes ne diffèrent que très peu de la cible, il est difficile de les distinguer. Supprimez un seul acide aminé et le peptide peut traverser une colonne de chromatographie presque exactement comme celui de pleine longueur, ce qui rend la séparation si difficile. Les groupes protecteurs ajoutent une autre complication. Si l'un n'est pas complètement éliminé entre les cycles, il peut gêner le couplage suivant et générer des produits non désirés.

Racémisation et formation d'aspartimide

Certaines impuretés de synthèse n'impliquent aucun ajout ou perte d'acide aminé.La racémisation (ou épimérisation) modifie la configuration stéréochimique d'un résidu. Le produit peut avoir exactement la même masse que la cible et une forme tridimensionnelle différente.La formation d'aspartimide est une réaction secondaire reconnue dans les séquences contenant des résidus d'acide aspartique sensibles. Elle passe par un intermédiaire cyclique, qui donne ensuite naissance à d'autres variantes peptidiques.La probabilité de ces réactions dépend de la séquence, des réactifs et des conditions de réaction. La longueur du peptide ne vous dira pas à elle seule si elles se sont produites.

Étape 2 – Ce qui peut mal tourner pendant le clivage et la purification

Une fois la synthèse terminée, le peptide doit être libéré de son support solide et ses groupes protecteurs restants supprimés. C'est de là que proviennent les impuretés liées au clivage. Les réactions ne se terminent pas toujours, et les conditions chimiques peuvent modifier le peptide de manière non prévue. Un groupe protecteur peut survivre au traitement et rester sur le peptide. L'acide fort utilisé pour le clivage, généralement un cocktail à base de TFA, peut également endommager les résidus sensibles : les carbocations réactifs libérés par les groupes protecteurs, par exemple, peuvent alkyler le tryptophane ou la méthionine si les piégeurs ne les interceptent pas en premier. Ce que vous avez à ce stade est un peptide brut, la molécule cible mélangée à des sous-produits de synthèse et d'autres matériaux liés au processus.

Pourquoi la purification ne peut pas éliminer toutes les impuretés

L'outil de travail pour la purification des peptides synthétiques est la chromatographie en phase inverse à haute performance (RP-HPLC). Elle sépare les molécules principalement par hydrophobicité, ce qui signifie avec quelle force elles sont retenues par la colonne par rapport à la phase mobile. Le problème est qu'une quasi-copie de la cible est retenue presque aussi fortement que la cible elle-même. Une séquence de délétion, une variante stéréochimique ou un peptide chimiquement modifié peuvent éluer juste à côté du pic principal, et avec certaines méthodes, ils ne sont jamais totalement résolus.Le résultat dépend donc de trois choses : le peptide lui-même, les impuretés particulières présentes dans le matériau brut et la sélectivité de la méthode choisie. Une pureté élevée signalée ne signifie pas que toute impureté possible a disparu.

Étape 3 – La lyophilisation peut-elle introduire de nouveaux problèmes ?

Après la purification, le peptide est généralement lyophilisé. La solution est congelée, la glace se sublime sous vide, et ce qui reste est une poudre sèche ou un gâteau. Une fois l'eau liquide éliminée, de nombreux peptides se conservent beaucoup mieux que dans une solution. Cela dit, la lyophilisation ne nettoie rien. Les composants non volatils de la solution finissent dans la poudre, et la dégradation se poursuit ensuite, généralement à un rythme plus lent.La poudre n'est pas non plus jamais complètement sèche. De nombreux peptides sont hygroscopiques, donc une partie de l'eau résiduelle reste liée, et les contre-ions issus de la synthèse et de la purification ajoutent également au poids. Un chiffre de pureté HPLC ne tient compte ni de l'un ni de l'autre. La teneur nette en peptide le fait, c'est pourquoi les deux chiffres pour un flacon peuvent être sensiblement différents. Le processus de séchage lui-même doit également être adapté au peptide, car la stabilité dépend de la séquence, de la formulation et des conditions de traitement. Un peptide lyophilisé ne doit pas être considéré comme chimiquement inerte.

Étape 4 – Comment le stockage et la manipulation modifient la composition peptidique

La synthèse et la purification se terminent ; la chimie ne le fait pas. Un peptide continue de changer lentement au fil du temps, et ces changements sont la source des impuretés liées au stockage. Quelles réactions prennent le dessus dépend principalement de la séquence et de ce à quoi le matériau est exposé.

Oxydation et liaisons disulfure

Tous les résidus ne sont pas également sensibles à l'oxydation. La méthionine est l'un des plus vulnérables. L'oxydation donne d'abord du sulfoxyde de méthionine, environ 16 Da plus lourd que le résidu parent ; poussez plus fort et vous obtenez la sulfone, à +32 Da. Ensuite, il y a la cystéine. Deux groupes thiol libres peuvent se joindre par une liaison disulfure, soit au sein de la même chaîne, soit à travers deux molécules, et c'est ainsi qu'apparaissent les dimères et les oligomères plus gros. Le tryptophane n'est pas non plus immunisé. La vitesse à laquelle tout cela se produit dépend de l'oxygène, de la lumière, des ions métalliques traces et du pH, et aucun peptide ne réagit tout à fait de la même manière.

Désamidation et hydrolyse : deux réactions provoquées par l'eau

Parmi tous les résidus, l'asparagine se désamide le plus facilement. La glutamine le fait aussi, juste plus lentement. Dans les deux cas, l'amide de la chaîne latérale finit sous forme d'acide carboxylique. La masse augmente d'environ 0,98 Da et la molécule gagne une charge négative, ce qui suffit pour que la forme désamidée se comporte différemment en solution et sur une colonne HPLC. L'hydrolyse est une autre affaire. Ici, l'eau attaque le squelette lui-même et coupe une liaison, et certaines séquences sont beaucoup plus sensibles que d'autres. L'acide aspartique peut se refermer en un cycle succinimide, et à partir de là, le résidu peut s'isomériser ou la chaîne peut se briser. Les liaisons Asp-Pro ont la réputation de céder dans des conditions acides. Tout cela dépend de la séquence. Deux peptides différents conservés dans le même congélateur peuvent vieillir à des vitesses très différentes.

Comment la température, l'humidité et l'air accélèrent les choses

Les conditions de stockage modifient la vitesse de plusieurs de ces réactions. Selon les conseils techniques de Merck, la composition en acides aminés et la séquence sont parmi les facteurs les plus importants dans la stabilité d'un peptide, et la forme lyophilisée dure généralement plus longtemps que le même peptide en solution. Si la séquence est sensible, l'humidité, la chaleur et une exposition prolongée à l'air rendent la dégradation plus probable. Les fournisseurs mettent également régulièrement en garde contre les cycles de congélation-décongélation répétés pour les solutions, et la solution habituelle est simple : divisez la solution en aliquotes avant de congeler. Et lorsqu'un produit possède ses propres données de stabilité, suivez-les. Il n'y a pas de température ou de durée de conservation unique qui fonctionne pour chaque peptide de recherche.

Impuretés peptidiques courantes et leur origine

Différentes impuretés ont des origines différentes et des signatures analytiques différentes. Le tableau liste des exemples courants.Traitez le tableau comme un guide, pas comme une clé d'identification. Deux impuretés sans rapport peuvent arriver à presque la même masse, et certains changements structurels laissent la masse totalement intacte.

Pourquoi les impuretés peptidiques comptent-elles pour les résultats de recherche ?

Il existe trois façons principales dont une impureté peut fausser un résultat de laboratoire. Elle peut avoir une activité biologique ou chimique propre. Elle peut modifier la quantité efficace du composé cible, de sorte que l'expérience est menée avec moins que prévu. Ou elle peut interférer avec la mesure elle-même. Laquelle de ces questions compte, et dans quelle mesure, dépend de l'impureté spécifique, de la quantité présente et de la méthode utilisée.Dans une étude de 2015 publiée dans le Journal of Pharmaceutical Analysis, des chercheurs de l'Université de Gand ont testé indépendamment un ensemble de peptides synthétiques de quorum sensing qui avaient été commandés avec une pureté demandée d'au moins 95 %. Seuls environ 44 % répondaient à cette spécification selon les procédures des chercheurs. Nombre des impuretés qu'ils ont identifiées étaient des acides aminés manquants, et dans un échantillon, le composé principal avait une structure différente du peptide visé. Pour les peptides qu'ils ont étudiés, la pureté rapportée par le fournisseur et la pureté mesurée indépendamment pouvaient différer considérablement. L'étude ne montre pas que le même écart existe chez tous les fournisseurs actuels.Un pourcentage seul ne vous dira pas si une impureté est significative. La même petite quantité peut être critique dans une expérience et sans importance dans la suivante. Imaginez une variante structurelle mineure qui lie toujours le récepteur que vous étudiez : dans un essai de liaison sensible, elle peut fausser le résultat. Un niveau similaire d'une impureté sans rapport pourrait ne pas être enregistré du tout dans un système différent. C'est pourquoi la littérature traite généralement le profilage des impuretés comme faisant partie de l'interprétation des études peptidiques, et de la décision quant à la confiance que l'on peut accorder aux données analytiques.

Les tests analytiques peuvent-ils détecter toutes les impuretés peptidiques ?

Non. Il n'existe aucune méthode unique qui trouve et quantifie toutes les impuretés possibles. Chaque technique vous dit quelque chose de différent sur la composition, l'identité ou la pureté, et chacune a des choses qu'elle manque.En HPLC, les composants sont séparés dans un ensemble fixe de conditions. Pour qu'une impureté apparaisse, elle doit produire un signal que le détecteur peut enregistrer et sortir de la colonne assez clairement en dehors du pic principal. Si elle co-élue avec la cible, ou si elle n'absorbe presque pas à la longueur d'onde choisie, elle peut passer inaperçue. La spectrométrie de masse regarde l'échantillon différemment. Parce qu'elle lit directement la masse moléculaire, les variantes de séquence et les modifications chimiques deviennent beaucoup plus faciles à reconnaître. Avec un instrument à haute résolution, même le déplacement de désamidation de ~1 Da peut être distingué du pic naturel de l'isotope ¹³C situé juste à côté. Ce que la SM ne peut pas faire seule, c'est distinguer les composés de masse identique, les stéréoisomères par exemple ; ceux-ci nécessitent une séparation supplémentaire ou un travail structurel.C'est pourquoi les deux sont si souvent combinés, sous forme de LC-MS : ensemble, ils montrent beaucoup plus que chacun ne le fait seul. Un chiffre de pureté HPLC n'a de sens qu'à côté de la méthode qui le sous-tend, ce qui signifie ce que cette méthode peut détecter et quelles impuretés elle a été conçue pour rechercher.

Que vous dit réellement un COA de lot sur les impuretés ?

Un certificat d'analyse (COA) est l'enregistrement des résultats de test pour un matériau ou un lot de production particulier. Un COA spécifique à un lot qui liste à la fois les méthodes et les résultats vous indique la pureté et l'identité de ce lot le jour où il a été testé. Il ne peut pas prouver que toute impureté possible est absente, et il n'est pas destiné à le faire.Lors de la lecture de la documentation sur les peptides de recherche, ces détails méritent d'être vérifiés :Identification du lot : le rapport appartient-il au matériel qui a été fourni ?Méthodes analytiques : quelles techniques ont été utilisées pour évaluer la pureté, l'identité et d'autres attributs de qualité ?Résultats rapportés : le document donne-t-il des valeurs mesurées, ou seulement une spécification générale telle que « ≥98 % » ?Date de test : quand les mesures ont-elles été prises ?Limites de la méthode : les tests peuvent-ils détecter les impuretés qui comptent pour la recherche visée ?Un COA est aussi une capture d'écran. Il ne dit rien sur le fait que la composition tiendra le coup pendant l'expédition et le stockage ultérieurs. Des tests indépendants peuvent soutenir les résultats rapportés, mais seulement dans la mesure où les méthodes, la compétence du laboratoire et un lien traçable entre l'échantillon testé et le lot fourni le permettent.Usage de recherche uniquement : les peptides discutés ici sont des matériaux de recherche en laboratoire, non des produits destinés à un usage humain ou animal. Cet article couvre les impuretés chimiques et la façon dont elles sont analysées ; il ne traite pas des applications médicales.RéférencesD’Hondt M, et al. (2014). Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 101, 2–30.Verbeke F, et al. (2015). Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 5(3), 169–181.Merck. Peptide Stability and Potential Degradation Pathways. Article technique.Sigma-Aldrich. Handling and Storage Guidelines for Peptides and Proteins. Conseils techniques.