Cómo nacen las impurezas de los péptidos: qué puede salir mal entre la síntesis y el almacenamiento

Las impurezas peptídicas son cualquier componente de una muestra de péptido que no sea el péptido pretendido. Algunas son el propio péptido en forma alterada: un residuo faltante o modificado, o un cambio en la estructura. Otras son residuos del proceso que permanecen después de la fabricación. En los péptidos de investigación, la mayoría de las impurezas pueden rastrearse hasta la síntesis, la escisión y desprotección, o la degradación que continúa durante el procesamiento y el almacenamiento. Las secuencias eliminadas y truncadas, las formas oxidadas y desamidadas, y los solventes o reactivos residuales se encuentran entre los más comunes.Sus orígenes difieren, y también lo hace la importancia de cada una. Algunas se forman antes de que el péptido esté completamente ensamblado. Otras aparecen después de la purificación, en un lote que cumplía con su especificación de pureza cuando se probó. Saber dónde es probable que ocurra un cambio hace que los resultados analíticos sean más fáciles de leer y da a los investigadores un lugar por donde empezar cuando los experimentos no coinciden entre sí.

¿Qué son las impurezas peptídicas?

En pocas palabras, una impureza es cualquier componente de la muestra que no sea el péptido pretendido. Puede ser una copia modificada del péptido, o algo que quedó después de fabricarlo. Los analistas suelen clasificar las impurezas en dos grupos.Las impurezas relacionadas con el péptido forman el primer grupo. Piense en ellas como copias cercanas del objetivo: un residuo perdido o ganado, una cadena lateral que lleva el grupo químico incorrecto, un estereocentro invertido. Las secuencias de deleción pertenecen aquí, al igual que los péptidos oxidados y desamidados.El segundo grupo cubre todo lo que no es péptido: solventes residuales, reactivos de síntesis sobrantes y otros residuos del proceso. El agua y los contraiones son un caso ligeramente diferente. Un péptido purificado con TFA suele terminar como su sal de trifluoroacetato, o como un acetato después del intercambio de contraiones, y casi siempre queda un poco de agua. Ambos tienden a informarse por sí solos en lugar de agruparse con las impurezas.La división importa para entender la pureza del péptido. Un porcentaje de pureza HPLC describe la proporción relativa de los componentes que se detectaron, bajo un método particular. No le dice cuánto péptido hay en el vial por peso. Ese segundo número es el contenido neto de péptido, y la brecha entre los dos es más notable en materiales de investigación suministrados como polvo liofilizado.

Etapa 1 – Cómo se forman las impurezas durante la síntesis de péptidos

La mayoría de los péptidos de investigación sintéticos provienen de la síntesis de péptidos en fase sólida, o SPPS. La cadena en crecimiento se asienta sobre perlas de resina, y los aminoácidos se añaden uno por uno. Cada ciclo debe ejecutarse casi hasta completarse; si no lo hace, el error permanece en esa cadena durante el resto de la síntesis. Quizás un residuo no se acopla, o se acopla donde no debería. Quizás un paso se detiene a mitad de camino, o una reacción secundaria cambia la cadena. Cada uno de estos termina como una impureza. Las secuencias más largas dan a estos eventos más posibilidades de ocurrir. D’Hondt y sus colegas revisan las principales clases de impurezas relacionadas con los péptidos vinculadas a la síntesis y el procesamiento posterior.

Secuencias faltantes, adicionales e incompletas

Tres impurezas relacionadas con la secuencia aparecen con más frecuencia:Secuencias de deleción: faltan uno o más aminoácidos, típicamente porque un paso de acoplamiento no llegó hasta el final.Secuencias de inserción: un aminoácido extra se ha deslizado en la cadena.Secuencias truncadas: la cadena dejó de crecer antes de alcanzar su longitud total.Debido a que estas variantes difieren tan poco del objetivo, es difícil distinguirlas de él. Elimine un solo aminoácido y el péptido puede correr a través de una columna de cromatografía casi exactamente como el de longitud completa, lo cual es lo que lo hace tan obstinado de separar. Los grupos protectores añaden otra complicación. Si uno no se elimina completamente entre ciclos, puede interponerse en el camino del siguiente acoplamiento y generar productos que nadie quería.

Racemización y formación de aspartimida

Algunas impurezas de síntesis no implican añadir o perder un aminoácido en absoluto.La racemización (o epimerización) cambia la configuración estereoquímica de un residuo. El producto puede tener exactamente la misma masa que el objetivo y una forma tridimensional diferente.La formación de aspartimida es una reacción secundaria reconocida en secuencias con residuos de ácido aspártico susceptibles. Pasa por un intermedio cíclico, que luego da lugar a otras variantes peptídicas.La probabilidad de estas reacciones depende de la secuencia, los reactivos y las condiciones de reacción. La longitud del péptido por sí sola no le dirá si ocurrieron.

Etapa 2 – Qué puede salir mal durante la escisión y la purificación

Una vez terminada la síntesis, el péptido debe liberarse de su soporte sólido y eliminarse los grupos protectores restantes. Aquí es de donde provienen las impurezas relacionadas con la escisión. Las reacciones no siempre terminan, y las condiciones químicas pueden modificar el péptido de formas que nadie pretendía. Un grupo protector puede sobrevivir al tratamiento y permanecer en el péptido. El ácido fuerte utilizado para la escisión, generalmente un cóctel a base de TFA, también puede dañar residuos sensibles: los carbocationes reactivos liberados de los grupos protectores, por ejemplo, pueden alquilar triptófano o metionina si los eliminadores no los atrapan primero. Lo que tiene en este punto es péptido crudo, la molécula objetivo mezclada con subproductos de síntesis y otro material relacionado con el proceso.

Por qué la purificación no puede eliminar todas las impurezas

El caballo de batalla para purificar péptidos sintéticos es la cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC). Separa las moléculas principalmente por hidrofobicidad, lo que significa con qué fuerza son retenidas por la columna en relación con la fase móvil. El problema es que una copia cercana del objetivo se retiene casi con tanta fuerza como el objetivo mismo. Una secuencia de deleción, una variante estereoquímica o un péptido químicamente modificado pueden eluir justo al lado del pico principal, y con algunos métodos nunca se resuelve por completo.Por lo tanto, el resultado depende de tres cosas: el péptido mismo, las impurezas particulares en el material crudo y qué tan selectivo es el método elegido. Una pureza reportada alta no significa que toda impureza posible haya desaparecido.

Etapa 3 – ¿Puede la liofilización introducir nuevos problemas?

Después de la purificación, el péptido suele liofilizarse. La solución se congela, el hielo se sublima al vacío y lo que queda es un polvo seco o pastel. Una vez que el agua líquida se ha ido, muchos péptidos se mantienen mucho mejor de lo que lo harían en solución. Dicho esto, la liofilización no limpia nada. Los componentes no volátiles de la solución terminan en el polvo, y la degradación continúa después, típicamente a un ritmo más lento.Tampoco el polvo está nunca completamente seco. Muchos péptidos son higroscópicos, por lo que algo de agua residual permanece unida, y los contraiones de la síntesis y purificación también añaden peso. Una cifra de pureza HPLC no cuenta ninguna de las dos. El contenido neto de péptido sí, que es la razón por la cual los dos números para un vial pueden sentarse notablemente aparte. El proceso de secado en sí también debe coincidir con el péptido, porque la estabilidad depende de la secuencia, la formulación y las condiciones de procesamiento. Un péptido liofilizado no debe tratarse como químicamente inerte.

Etapa 4 – Cómo el almacenamiento y la manipulación cambian la composición del péptido

La síntesis y la purificación terminan; la química no. Un péptido sigue cambiando lentamente con el tiempo, y esos cambios son de donde provienen las impurezas relacionadas con el almacenamiento. Qué reacciones toman la iniciativa se reduce principalmente a la secuencia y a lo que el material está expuesto.

Oxidación y enlaces disulfuro

No todos los residuos son igualmente sensibles a la oxidación. La metionina es uno de los más vulnerables. La oxidación primero da sulfóxido de metionina, aproximadamente 16 Da más pesado que el residuo principal; presione más fuerte y obtendrá la sulfona, a +32 Da. Luego está la cisteína. Dos grupos tiol libres pueden unirse a través de un enlace disulfuro, ya sea dentro de la misma cadena o a través de dos moléculas, y así es como aparecen dímeros y oligómeros más grandes. El triptófano tampoco es inmune. Qué tan rápido sucede todo esto depende del oxígeno, la luz, los iones de metales traza y el pH, y no hay dos péptidos que respondan de la misma manera.

Desamidación e hidrólisis: dos reacciones impulsadas por el agua

De todos los residuos, la asparagina se desamida más fácilmente. La glutamina también lo hace, solo más lentamente. En ambos casos, la amida de la cadena lateral termina como un ácido carboxílico. La masa aumenta aproximadamente 0.98 Da y la molécula gana una carga negativa, lo cual es suficiente para que la forma desamidada se comporte de manera diferente en solución y en una columna HPLC. La hidrólisis es otro asunto. Aquí el agua ataca el esqueleto mismo y corta un enlace, y algunas secuencias son mucho más susceptibles que otras. El ácido aspártico puede cerrarse en un anillo de succinimida, y a partir de ahí el residuo puede isomerizarse o la cadena puede romperse. Los enlaces Asp-Pro tienen reputación de ceder en condiciones ácidas. Todo esto depende de la secuencia. Dos péptidos diferentes mantenidos en el mismo congelador pueden envejecer a velocidades muy diferentes.

Cómo la temperatura, la humedad y el aire aceleran las cosas

Las condiciones de almacenamiento cambian la tasa de muchas de estas reacciones. Según la guía técnica de Merck, la composición de aminoácidos y la secuencia se encuentran entre los mayores factores en la estabilidad de un péptido, y la forma liofilizada generalmente dura más que el mismo péptido en solución. Si la secuencia es sensible, la humedad, el calor y la exposición prolongada al aire hacen que la degradación sea más probable. Los proveedores también advierten rutinariamente contra los ciclos repetidos de congelación-descongelación para soluciones, y la solución habitual es simple: divida la solución en alícuotas antes de congelar. Y cuando un producto tiene sus propios datos de estabilidad, sígalos. No hay una temperatura o vida útil que funcione para todos los péptidos de investigación.

Impurezas peptídicas comunes y de dónde vienen

Diferentes impurezas tienen diferentes orígenes y diferentes firmas analíticas. La tabla enumera ejemplos comunes.Trate la tabla como una guía, no como una clave de identificación. Dos impurezas no relacionadas pueden aterrizar casi a la misma masa, y algunos cambios estructurales dejan la masa intacta por completo.

¿Por qué importan las impurezas peptídicas para los resultados de la investigación?

Hay tres formas principales en que una impureza puede alterar un resultado de laboratorio. Puede tener actividad biológica o química propia. Puede cambiar la cantidad efectiva del compuesto objetivo, por lo que el experimento se ejecuta con menos de lo planeado. O puede interferir con la medición misma. Qué es lo que importa, y en qué medida, se reduce a la impureza específica, cuánta hay presente y el método que se está utilizando.En un estudio de 2015 en el Journal of Pharmaceutical Analysis, investigadores de la Universidad de Gante probaron independientemente un conjunto de péptidos sintéticos de quorum sensing que se habían pedido con una pureza solicitada de al menos el 95%. Solo alrededor del 44% cumplió con esa especificación bajo los procedimientos de los investigadores. Muchas de las impurezas que identificaron eran aminoácidos faltantes, y en una muestra el compuesto principal tenía una estructura diferente a la del péptido pretendido. Para los péptidos que investigaron, la pureza reportada por el proveedor y la pureza medida independientemente podrían diferir mucho. El estudio no muestra que la misma brecha exista en todos los proveedores actuales.Un porcentaje por sí solo no le dirá si una impureza es significativa. La misma pequeña cantidad puede ser crítica en un experimento e irrelevante en el siguiente. Imagínese una variante estructural menor que todavía se une al receptor que está estudiando: en un ensayo de unión sensible, puede distorsionar el resultado. Un nivel similar de alguna impureza no relacionada podría no registrarse en absoluto en un sistema diferente. Es por eso que la literatura generalmente trata el perfilado de impurezas como parte de la interpretación de los estudios de péptidos, y de decidir hasta qué punto se puede confiar en los datos analíticos.

¿Pueden las pruebas analíticas detectar cada impureza peptídica?

No. No existe un método único que encuentre y cuantifique cada impureza posible. Cada técnica le dice algo diferente sobre la composición, la identidad o la pureza, y cada una tiene cosas que pierde.En HPLC, los componentes se separan bajo un conjunto fijo de condiciones. Para que aparezca una impureza, debe producir una señal que el detector pueda registrar y salir de la columna claramente lo suficientemente separada del pico principal. Si co-eluye con el objetivo, o apenas absorbe en la longitud de onda elegida, puede pasar desapercibida. La espectrometría de masas observa la muestra de manera diferente. Debido a que lee la masa molecular directamente, las variantes de secuencia y las modificaciones químicas se vuelven mucho más fáciles de reconocer. Con un instrumento de alta resolución, incluso el cambio de desamidación de ~1 Da puede distinguirse del pico natural del isótopo ¹³C que se encuentra justo al lado. Lo que la MS no puede hacer por sí sola es distinguir compuestos de masa idéntica, estereoisómeros por ejemplo; esos necesitan separación adicional o trabajo estructural.Es por eso que los dos se combinan tan a menudo, como LC-MS: juntos muestran mucho más que cualquiera de los dos solo. Una cifra de pureza HPLC solo tiene sentido junto al método detrás de ella, lo que significa qué puede detectar ese método y qué impurezas fue diseñado para buscar.

¿Qué le dice realmente un COA de lote sobre las impurezas?

Un certificado de análisis (COA) es el registro de resultados de pruebas para un material o lote de producción en particular. Un COA específico del lote que enumera tanto métodos como resultados le dice la pureza y la identidad de ese lote en el día en que se probó. No puede probar que cada impureza posible esté ausente, y no está destinado a hacerlo.Al leer la documentación del péptido de investigación, vale la pena verificar estos detalles:Identificación del lote: ¿el informe pertenece al material que se suministró?Métodos analíticos: ¿qué técnicas se utilizaron para evaluar la pureza, la identidad y otros atributos de calidad?Resultados informados: ¿el documento da valores medidos, o solo una especificación general como “≥98%”?Fecha de prueba: ¿cuándo se tomaron las medidas?Limitaciones del método: ¿pueden las pruebas detectar las impurezas que importan para la investigación pretendida?Un COA también es una instantánea. No dice nada sobre si la composición se mantendrá durante el envío y el almacenamiento posteriores. Las pruebas independientes pueden respaldar los resultados informados, pero solo en la medida en que los métodos, la competencia del laboratorio y un vínculo rastreable entre la muestra probada y el lote suministrado lo permitan.Solo para uso en investigación: los péptidos discutidos aquí son materiales de investigación de laboratorio, no productos para uso humano o animal. Este artículo cubre las impurezas químicas y cómo se analizan; no aborda aplicaciones médicas.ReferenciasD’Hondt M, et al. (2014). Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 101, 2–30.Verbeke F, et al. (2015). Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 5(3), 169–181.Merck. Peptide Stability and Potential Degradation Pathways. Artículo técnico.Sigma-Aldrich. Handling and Storage Guidelines for Peptides and Proteins. Guía técnica.