Endotoxinas en péptidos de investigación: qué son, de dónde provienen y por qué son importantes

Las endotoxinas son fáciles de pasar por alto al trabajar con péptidos de investigación. Puede que no haya nada inusual en la apariencia de una muestra y no es necesario que haya bacterias vivas presentes. Sin embargo, el material bacteriano dejado durante la producción o manipulación puede seguir ahí.Para algunos experimentos, eso importa. Las endotoxinas bacterianas, o lipopolisacáridos (LPS), son biológicamente activas. Las células pueden responder al LPS independientemente de cualquier péptido que se esté estudiando. En un ensayo basado en células, particularmente uno que involucre señalización inmunitaria o inflamatoria, eso crea un problema obvio: ¿qué parte de la respuesta observada provino del péptido y qué parte provino de la contaminación?Es por eso que las endotoxinas en los péptidos merecen ser verificadas en lugar de simplemente asumir que están ausentes. Las pruebas pueden detectarlas y, dependiendo del método, medir su nivel. Qué tan importante sea ese resultado dependerá del experimento en sí.

¿Qué son las endotoxinas?

Para entender qué son las endotoxinas en los péptidos, ayuda comenzar con las bacterias de las que provienen. Las bacterias gramnegativas tienen una membrana externa que contiene lipopolisacáridos, comúnmente llamados LPS. Estas moléculas son las endotoxinas bacterianas que los investigadores analizan.El LPS puede ser liberado de las células bacterianas, particularmente a medida que las células mueren y se descomponen. Una vez que eso sucede, deshacerse de las bacterias no necesariamente deshace el material que liberaron. Por lo tanto, una preparación peptídica puede contener endotoxina incluso cuando ya no hay bacterias gramnegativas viables presentes.Esto también explica por qué la esterilidad y las pruebas de endotoxinas no deben tratarse como lo mismo. Una muestra estéril aún puede contener LPS.Existe una distinción similar entre endotoxinas y pirógenos. Los términos a veces aparecen juntos, pero no son intercambiables. Las endotoxinas son un tipo de pirógeno. Otras sustancias también pueden tener actividad pirogénica, mientras que las endotoxinas bacterianas se refieren específicamente al LPS asociado con bacterias gramnegativas.

¿Cómo pueden entrar las endotoxinas en una preparación peptídica?

No hay un punto único en el que deba ocurrir la contaminación. Puede suceder antes de que exista la preparación peptídica terminada.El agua es una posible fuente. Las materias primas y los productos químicos de procesamiento también pueden introducir contaminación, al igual que los equipos o los componentes de embalaje. Las bacterias gramnegativas pueden haber estado presentes en una etapa anterior y ya no ser viables para cuando se prueba el material final. El LPS que liberaron puede permanecer.La manipulación en laboratorio añade otra ruta posible. Se ha informado en la literatura científica sobre la contaminación por endotoxinas en preparaciones peptídicas, incluida la contaminación introducida durante los procedimientos de laboratorio de rutina. El LPS no tiene que estar presente en cantidades visibles para volverse relevante para un experimento biológico.Eliminar las bacterias más adelante en el proceso tampoco resuelve necesariamente el problema. Las bacterias y el LPS liberado de sus paredes celulares son objetivos físicamente diferentes. Un proceso que trata eficazmente con microorganismos viables puede, por lo tanto, dejar este material atrás.Su presencia no puede establecerse por la apariencia, la esterilidad o las suposiciones sobre cómo se manipuló el péptido. Requiere una prueba diseñada para detectar endotoxinas.

¿Por qué las endotoxinas pueden afectar los resultados experimentales?

El LPS tiene su propia actividad biológica. Las células que participan en las respuestas inmunitarias innatas pueden reconocerlo y responder a través de vías que afectan la señalización inflamatoria y la producción de citoquinas. La cantidad de LPS necesaria para producir una respuesta medible varía según el modelo experimental.Esto puede causar un problema muy práctico en la investigación de péptidos.Supongamos que se añade una preparación peptídica a células cultivadas y cambia la expresión de citoquinas. Si la misma preparación contiene LPS biológicamente activo, el péptido ya no es el único componente capaz de producir una respuesta. Parte del cambio observado puede estar relacionado con el contaminante.Este tipo de interferencia se ha discutido en investigaciones que involucran péptidos sintéticos y otras preparaciones biológicas. La contaminación por endotoxinas puede producir efectos que, de otro modo, podrían atribuirse al material bajo investigación.La preocupación es especialmente relevante cuando los investigadores ya están estudiando señalización inmunitaria, citoquinas, macrófagos, monocitos o respuestas inflamatorias. En estos modelos, el LPS puede afectar algunos de los mismos puntos finales que se están midiendo. Saber si está presente en la muestra facilita la contabilización de esa fuente potencial de interferencia.

¿Cómo se analizan los péptidos en busca de endotoxinas?

Las pruebas de endotoxinas en péptidos examinan directamente una muestra en busca de endotoxinas bacterianas. Es una medición analítica separada en lugar de algo que pueda determinarse a partir de la apariencia del material o inferirse de la esterilidad.Las pruebas de endotoxinas bacterianas (BET) incluyen varios enfoques establecidos. Los métodos tradicionales utilizan lisado de amebocitos y pueden producir resultados de coágulo de gel, turbidimétricos o cromogénicos. También hay métodos recombinantes disponibles, incluidos ensayos basados en el Factor C recombinante.Hay mucho más detrás de estos métodos de lo que sugieren sus nombres, incluida la preparación de la muestra, la interferencia del ensayo y la idoneidad del método. Una comparación detallada pertenece a una discusión separada. Para las pruebas de endotoxinas en péptidos, el punto relevante aquí es que se necesita un ensayo dedicado y que el ensayo debe funcionar correctamente con el material que se está probando.Un resultado documentado también dice más a un investigador que una declaración general como “libre de endotoxinas”. Proporciona una base analítica para describir lo que se encontró en el material probado.Cada lote de péptidos de investigación Purita se somete a dos rondas de pruebas independientes de terceros, incluidas pruebas de endotoxinas. Purita es el único proveedor de péptidos de investigación que aplica este nivel de pruebas independientes a cada lote, con un COA específico del lote que proporciona a los investigadores documentación analítica vinculada al lote específico.Los péptidos Purita se suministran estrictamente para fines de investigación y no están destinados para uso humano o veterinario.

¿Qué significan los niveles de endotoxinas?

La endotoxina se reporta comúnmente en Unidades de Endotoxina (UE). Estas unidades describen la actividad biológica en lugar de simplemente dar la masa de material bacteriano en una muestra.No existe un valor universal para los niveles aceptables de endotoxinas en péptidos que pueda aplicarse a cada situación de investigación. El significado de un resultado depende en parte de para qué se utilizará el material para estudiar y qué tan sensible es ese sistema experimental al LPS.Los productos farmacéuticos regulados proporcionan un ejemplo útil de por qué un solo número no funciona. Sus límites de endotoxinas pueden depender de factores como la vía de administración y la dosis máxima. Esos límites se desarrollaron para usos regulados particulares y no deberían simplemente transferirse a péptidos de investigación como si representaran un estándar de laboratorio general.Los modelos de investigación introducen sus propias diferencias. Un ensayo que examina la señalización inflamatoria puede reaccionar al LPS de manera diferente a un experimento centrado en un punto final no relacionado. El tipo de célula, las condiciones experimentales y la medición que se está tomando pueden afectar la relevancia de un nivel en particular.Así que el número es útil, pero necesita contexto. Un resultado medido dice a los investigadores lo que se detectó en el material probado. Si ese nivel importa para un experimento en particular depende del modelo y la pregunta bajo investigación.

¿La filtración de péptidos elimina las endotoxinas?

No necesariamente.La suposición es comprensible. La filtración se asocia comúnmente con la eliminación de microorganismos, por lo que puede parecer que filtrar una preparación peptídica se encargaría de la contaminación por endotoxinas al mismo tiempo. ¿La filtración de péptidos elimina las endotoxinas una vez que el LPS ya está presente? No se puede asumir que la filtración esterilizante ordinaria haga eso.Una bacteria y el LPS liberado de su membrana externa son cosas muy diferentes. Por lo tanto, eliminar microorganismos viables no garantiza una reducción comparable en la contaminación que ya está presente en la preparación.Existen enfoques especializados diseñados para reducir o eliminar endotoxinas, pero su eficacia depende del material y del proceso. Por lo tanto, es preferible prevenir la contaminación antes en la producción y manipulación que suponer que simplemente se puede filtrar después.Esto también explica por qué la filtración y las pruebas de endotoxinas en péptidos proporcionan información diferente. Una preparación filtrada se ha sometido a un paso de procesamiento. Una prueba de endotoxina mide realmente si está presente en la muestra probada.

¿Qué puede decirle realmente un resultado de endotoxinas?

Una prueba de endotoxinas responde a una pregunta estrecha pero útil. Puede mostrar si se detectó endotoxina bacteriana y, cuando se utiliza un método cuantitativo, el nivel medido en las condiciones de ese ensayo.No establece todas las características de una preparación peptídica. Las pruebas de endotoxinas no sustituyen a las pruebas de identidad, concentración, esterilidad u otros parámetros analíticos. Un resultado obtenido para un lote tampoco debe tratarse automáticamente como el resultado para otro lote.Su valor se vuelve más claro cuando el propio sistema experimental puede responder al LPS. Conocer el resultado elimina una incógnita de la muestra y da a los investigadores otra información a considerar al interpretar lo que observan.Para algunos experimentos, la relevancia puede ser limitada. Para otros, especialmente aquellos que involucran respuestas inmunitarias e inflamatorias, el LPS no medido podría afectar los mismos puntos finales bajo investigación. En esa situación, saber que el péptido de investigación ha sido realmente probado es considerablemente más informativo que simplemente asumir que el contaminante está ausente.

Fuentes

FDA – Endotoxinas/pirógenos bacterianos – endotoxinas bacterianas, fuentes de contaminación, límites de endotoxinas, filtración y despirogenación.FDA – Pruebas de pirógenos y endotoxinas: preguntas y respuestas – guía actual de la FDA sobre pruebas de endotoxinas y pirógenos.USP <86> – Prueba de endotoxinas bacterianas utilizando reactivos recombinantes – métodos de Factor C recombinante y reactivo en cascada recombinante.Majde JA. Contaminantes de la pared celular microbiana en péptidos: una fuente potencial de artefactos fisiológicos – contaminación por endotoxinas de preparaciones peptídicas y su potencial para producir artefactos experimentales.Weinstein JR et al. El lipopolisacárido es un contaminante frecuente y significativo en los factores activadores de la microglía – contaminación por LPS en reactivos de investigación, incluidas las preparaciones de péptidos sintéticos, y sus efectos en las respuestas experimentales.Faust C et al. Impacto de los lipopolisacáridos en el cultivo y la expresión de proteínas recombinantes en células HEK-293 – efectos dependientes de la concentración de LPS en un sistema experimental basado en células.